Кафедра клеточной биологии и гистологии

 

 "Современная оптическая микроскопия" (д.б.н., проф. И.А.Воробьев)



Знакомство с конструкцией микроскопа. Оптические элементы микроскопа: объектив, окуляр, конденсор, осветитель. Настройка света в микроскопии. Предел разрешения светового микроскопа (теория Аббе, критерий Рэлея, критерий Спарроу). Микроскопия в светлом поле, фазовый и интерференционный контраст, темнопольная микроскопия, флуоресцентная микроскопия. Основы конфокальной микроскопии (лазерная сканирующая микроскопия, микроскопия на основе диска Нипкова, двухфотонная микроскопия). Цифровые (ПЗС) камеры и их использование в микроскопии. Основные представления о красителях, применяемых во флуоресцентной микроскопии (органические флуорохромы, флуоресцентные белки, квантовые точки). Источники света в микроскопии. Прижизненные наблюдения клеток. Цифровая запись изображения в микроскопии. Преодоление дифракционного предела и регистрация отдельных молекул в микроскопии. Основы обработки изображения (избирательное контрастирование, пространственная фильтрация, приближение записанного изображения к визуально воспринимаемому).

План лекций.

Лекция 1
Введение. Строение человеческого глаза. Геометрическое рассмотрение микроскопа. Лупа (микроскоп Левенгука) – увеличение, ход лучей. Формирование изображения в микроскопе с объективом и окуляром.

Лекция 2.
Формирование изображения в микроскопе на основе физической оптики – теория Аббе. Числовая апертура объектива. Ограничение разрешающей способности микроскопа – диск Эри и критерий Рэлея. Функция передачи контраста в микроскопии.

Лекция 3.
Аберрации простой линзы и их устранение в объективе микроскопа. Объектив микроскопа: конструкция объектива и основные характеристики (степень исправления аберраций; числовая апертура; увеличение; наличие иммерсии; рабочий отрезок; коррекция на рабочее расстояние). Основные типы объективов. Применение иммерсии.

Лекция 4.
Окуляр микроскопа. Глубина поля зрения и понятие резкого изображения. Оптический срез.
Работа с бинокулярной насадкой. Конденсор микроскопа – основные типы. Осветитель: конструкция и применяемые источники света. Понятие цветовой температуры и применение светофильтров в светлопольной микроскопии. Механические элементы микроскопа Сопряженные плоскости в микроскопе с осветителем и конденсором. Установка света по Келеру.

Лекция 5.
Методы усиления контраста в микроскопии в проходящем свете: темное поле, фазовый контраст, интерференционный контраст. Принципы методов. Дополнительное оборудование и настройка света при каждом методе наблюдения. Сравнение интерференционного и фазового контраста – преимущества и недостатки методов.

Лекция 6.
Флуоресцентный микроскоп: особенности конструкции (эпиосвещение, куб светофильров). Флуоресцентная микроскопия: принцип метода. Диаграмма Яблонского и правило Стокса. Светофильтры, применяемые для флуоресцентной микроскопии. Основные характеристики флуорохромов.

Лекция 7.
Флуоресцентная микроскопия: источники света (ртутная лампа и осветитель на ее основе; использование лазеров и светодиодов) и красители (органические флуорохромы, флуоресцентные белки).

Лекция 8.
Цифровая камера и цифровая микроскопия. Устройство ПЗС (цифровой) камеры. Установка камеры на микроскопе – эквивалентный размер пиксела. Чувствительность и разрешающая способность микроскопа с ПЗС камерой.

Лекция 9.
Конфокальный микроскоп: принцип работы и его практическая реализация. Системы конфокальной микроскопии - лазерная сканирующая микроскопия, микроскопия на основе диска Нипкова, двухфотонная микроскопия. Разрешающая способность конфокального микроскопа. Чувствительность конфокального микроскопа.

Лекция 10.
Цифровая микроскопия: получение и обработка изображения. Подбор условий записи изображения. Динамический диапазон камеры и его визуализация. Особенности микроскопии живых клеток (фоточувствительность клеток, автофлуоресценция).

Лекция 11.
Работа с цветными изображениями: понятие цветового пространства и особенности зрительного цветовосприятия. Способы кодировки цвета (RGB, CMYK, Lab). Компьютерная корректировка цветных изображений. Синтез псевдоцветных изображений. Основы морфометрии.

Лекция 12.
Современная флюоресцентная микроскопия: STED, STORM; PALM. Преодоление дифракционного предела. Микроскопия одиночных молекул.

Промежуточная аттестация

Практические занятия: запись изображения методом фазового контраста; анализ сальтаторных движений в клетках культуры ткани. Запись изображения диатомовых водорослей и практическое определение разрешающей способности микроскопа.

Сдача практической задачи.

Экзаменационные билеты


 Билет 1.
 1. Основные методы обработки изображения, получаемого в микроскопии.
 2. Преодоление дифракционного предела разрешения во флуоресцентной микроскопии.

Билет 2.
 1. Установка света для фазового контраста.
 2. Принцип работы ПЗС (цифровой) камеры.

Билет 3.
 1. Характеристики флуоресцентных красителей.
 2. Ход лучей в микроскопе с осветителем, конденсором, объективом и окуляром.

Билет 4.
 1. Лупа и ее увеличение.
 2. Лазерный конфокальный сканирующий микроскоп.

Билет 5.
 1. Аберрации линзы и их компенсация в объективе микроскопа.
 2. Куб светофильтров для флуоресцентной микроскопии.

Билет 6.
 1. Ход лучей в микроскопе только с объективом и окуляром.
 2. Правило Стокса и его использование во флуоресцентной микроскопии.

Билет 7.
 1. Сопряженные плоскости в светлопольном микроскопе.
 2. Микроскопия в темном поле – принцип метода.

Билет 8.
 1. Инвертированный микроскоп – особенности конструкции и оптики.
 2. Основные характеристики цифровых (ПЗС) камер.

Билет 9.
 1. Устройство объектива микроскопа. Маркировка объектива.
 2. Конфокальный микроскоп на основе диска Нипкова.

Билет 10.
 1. Разрешающая способность оптического прибора (критерий Релея и критерий Спарроу).
 2. Ход лучей и установка света для флуоресцентной микроскопии.

Билет 11.
 1. Строение окуляра микроскопа. Маркировка окуляра. Окуляр-микрометр.
 2. Сравнение дифференциального интерференционного и фазового контраста. Преимущества и недостатки методов.

Билет 12.
 1. Осветитель и источники света в микроскопии светлого поля.
 2. Обработка цифрового изображения – общие принципы.

Билет 13.
 1. Теорема дискретизации, и ее применение в микроскопии.
 2. Увеличение микроскопа и его поле зрения.

Билет 14.
 1. Правило Стокса и его использование во флуоресцентной микроскопии.
 2. Источники света, применяемые в микроскопии.

Билет 15.
 1. Конфокальная микроскопия – принцип метода.
 2. Формула тонкой линзы.

Билет 16.
 1. Многоцветные наборы светофильтров для флюоресцентной микроскопии.
 2. Приближение записанного цифрового изображения к визуально воспринимаемому.

Билет 17.
 1. Ртутная лампа – настройка осветителя и правила обращения.
 2. Применение иммерсии; виды иммерсии.

Билет 18.
 1. Типы микроскопических объективов и их применение.
 2. Требования к флуоресцентным красителям, используемым в микроскопии.

Билет 19.
 1. Числовая апертура и разрешающая способность микроскопа - теория Аббе.
 2. Дифференциальный интерференционный контраст. Принцип метода.

Билет 20.
 1. Установка света по Келеру (в проходящем свете).
 2. Фазово-контрастная микроскопия.Принцип метода.

Билет 21.
 1. Установка цифровой камеры на микроскоп.
 2. Светофильтры, применяемые во флуоресцентной микроскопии.

Список учебной литературы.

 Лэйси (под ред.).
 Inoue S. Video Microscopy. Plenum Press. 1986.

Компетенции


После прослушивания курса студент должен знать:

Конструкцию оптического микроскопа. Оптические элементы микроскопа: объектив, окуляр, конденсор, осветитель. Настройка света в микроскопии. Предел разрешения светового микроскопа (теория Аббе, критерий Рэлея, критерий Спарроу). Микроскопия в светлом поле, фазовый и интерференционный контраст, темнопольная микроскопия, флуоресцентная микроскопия. Основы конфокальной микроскопии (лазерная сканирующая микроскопия, микроскопия на основе диска Нипкова, двухфотонная микроскопия). Цифровые (ПЗС) камеры и их использование в микроскопии. Основные характеристики красителей, применяемых во флуоресцентной микроскопии (органические флуорохромы, флуоресцентные белки, квантовые точки). Источники света в микроскопии. Возможности прижизненных наблюдений клеток. Цифровую запись изображения в микроскопии. Преодоление дифракционного предела и регистрацию отдельных молекул в микроскопии. Основы обработки изображения (избирательное контрастирование, пространственная фильтрация, приближение записанного изображения к визуально воспринимаемому).

После прослушивания курса студент должен уметь:

Самостоятельно, пользуясь только техническим описанием, настроить свет в исследовательском микроскопе для различных режимов наблюдения. Определить параметры настройки цифровой камеры и конфокального микроскопа и подобрать оптимальные условия для записи изображения. Подобрать красители и наборы светофильтров для флуоресцентной микроскопии. Получить качественное изображение живых клеток методами фазового и интерференционного контраста, а также при флуоресцентной микроскпии..